سالانه بیش از دو میلیون عمل پیوند استخوان در سراسر جهان انجام می‌شود. اگرچه استخوان ظرفیت خود ترمیم شوندگی منحصر به فردی دارد، اما این توانایی محدود به شکستگی‌های کوچک به اندازه چند میلی‌متر است. در درمان نقایص استخوانی در مقیاس بزرگ، به ایمپلنت‌ها و ابزارهایی برای بازیابی عملکرد بافت مورد نیاز است. نقایص استخوانی با اندازه بحرانی ناشی از پارگی، عفونت، تومور یا ناهنجاری‌های استخوانی جمجمه صورت عمدتاً با اتوگرافت، آلوگرافت و زنوگرافت درمان می‌شوند. با این حال، این پیوندهای استخوان طبیعی دارای اشکالات جدی مانند منبع محدود، عوارض ناحیه اهداکننده و خطر تحریک پاسخ ایمنی هستند. بنابراین، مهندسی بافت استخوان، یک رویکرد امیدوارکننده برای از بین بردن این محدودیت‌ها است که در آزمایشگاه‌ها با شکل و ویژگی‌های مطلوب ساخته می‌شوند. ساخت داربست‌های پلیمری و کشت سلول روی آن‌ها یکی از روش‌های رایج در مهندسی بافت است. اگرچه پلیمرهای مصنوعی دارای خواص مکانیکی مناسبی برای جایگزینی برخی بافت‌های استخوانی هستند اما عموما آبگریز بوده و هیچ مکان شناسایی سلولی خاصی ندارند که منجر به میل ترکیبی و چسبندگی سلول شوند. با این حال برخی از پلیمرهای طبیعی، میل سلولی بالایی دارند، اما از نظر مکانیکی ضعیف هستند و استحکام لازم به عنوان یک ماده نگهدارنده استخوان را ندارند. محققان موفق شده‌اند تا با استفاده از روش پرینت زیستی سه بعدی و پلیمرهای PCL و ژلما (GelMA) داربست‌های دو جزئی حاوی سلول بسازند که همزمان با تحریک استخوان‌سازی، استحکام مکانیکی لازم برای تقلید بافت استخوان را فراهم می‌کند. پایداری ساختار و مقاومت مکانیکی بالای داربست‌های سه بعدی مورد نیاز برای بافت استخوان به طور کلی توسط پلیمرهای مصنوعی نظیر پلی اسید لاکتیک (PLA)، پلی اسید گلیکولیک (PGA) ، پلی اسید لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید (PLGA)، پلی روپیلن فومارات (PPF) و پلی ε-کاپرولاکتون (PCL) تامین می‌شود. پلیمر PCL به دلیل استحکام مکانیکی مناسب و محصولات جانبی ناشی از تخریب غیر سمی به طور گسترده‌ای در مهندسی بافت استخوان مورد استفاده قرار می‌گیرد. دمای انتقال شیشه‌ای پایین ( ۶۰^OC-)، دمای ذوب پایین (۶۰^OC) و دمای تجزیه بالا (۳۵۰^OC) منجر شده است تا کار با آن در مقایسه با سایر پلی‌استرها راحت‌تر باشد و اغلب در چاپ سه بعدی استفاده می‌شود. با این حال، ماهیت آبگریز و عدم وجود مکان‌های شناسایی سلولی منجر به میل سلولی ضعیف و کاهش چسبندگی سلول بر روی سطح می‌شود. بنابراین، PCL به طور کلی پس از اصلاح سطح با روش‌هایی مانند پلاسما اکسیژن، لیزر، عملیات شیمیایی (به عنوان مثال NaOH)، عامل دار شدن یا ترکیب با بیوسرامیک‌های مختلف (مانند هیدروکسی آپاتیت) و/یا پلیمرهای طبیعی که استخوان سازی را تحریک می‌کنند، استفاده می‌شود. هیدروژل GelMA به طور گسترده‌ای در کاربردهای استئوکندرال استفاده شده و باعث تحریک تمایز استخوانی و رسوب کلسیم در شرایط آزمایشگاهی و استخوان سازی درون غضروفی در شرایط درون‌تنی می‌شود.

در این پژوهش جوهر زیستی PCL و جوهر زیستی ژلما حاوی سلول‌های بنیادی پالپ دندان (DPSC) به صورت لایه لایه پرینت شدند. هدف از این مطالعه بررسی ویژگی‌های داربست دو جزئی بود که به دلیل وجود PCL  دارای یک استحکام مکانیکی مناسب برای جایگزینی بافت استخوان است. همچنین ژلما موجب بهبود چسبندگی و تحریک استخوان سازی می‌شود. اگرچه، ژلما در شرایط درون‌تنی سریعتر از PCL تجزیه می‌شود اما همچنان استحکام مکانیکی داربست دو جزئی توسط PCL در طول مدت زمان بازسازی بافت تامین می‌شود.

شکل ۱) نمایش شماتیک ساخت سه بعدی داربست دو جزئی PCL/GelMA. (a) فرآیند ساخت داربست PCL/GelMA، (b) نمای لایه اول و (c) نمای جانبی داربست چند لایه (پنج لایه). خاکستری: PCL و آبی: .GelMA

همان‌طور که در شکل ۱ نشان داده شده است PCL و جوهر ژلما هر یک در دو کارتریج جدا ریخته شدند و با کمک پرینتر سه بعدی Bioplotter EnvisionTec 3D در ۵ لایه پرینت شدند. نهایتا ساختار نهایی به مدت ۵ ثانیه در فاصله‌ی ۳ سانتی‌متری تحت تابشUV  با طول موج ۳۶۵ نانومتر قرار گرفت. خلاصه‌ای از شرایط پرینت در جدول زیر آورده شده است.

پایداری داربست‌ها با انکوبه کردن آنها در PBS (pH 7.4) به مدت ۳ هفته مورد مطالعه قرار گرفت. نرخ تخریب PCL بسیار کم بود و در عرض ۲۱ روز تغییر قابل توجهی مشاهده نشد. از داربست GelMA فاقد PCL به عنوان کنترل استفاده شد. در پایان ۲۱ روز انکوباسیون، کاهش وزن برای داربست‎های PCL/GelMA و GelMA به ترتیب ۲% و ۱۰% بود. در مطالعه ۳ هفته‌ای تجزیه، انتظار نمی‌رود که PCL تخریب شود، اما GelMA تجزیه می‌شود. وزن خشک داربست PCL/GelMA بسیار بیشتر از داربست GelMA بود، بنابراین کاهش وزن ۲ درصدی توسط داربست PCL/GelMA (ناشی از از دست دادن تنها جزء GelMA آن) تقریباً برابر با ۱۰ درصد کاهش وزن است.

هیدروژل‌ها به واسطه‌ی جذب مقادیر زیادی آب از محیط ماتریکس خارج سلولی به سلول‌های بارگذاری شده در آن‌ها اجازه‌ی‌ تبادل اکسیژن، مواد مغذی و ضایعات متابولیکی را می‌دهند. محتوای آب تعادلی هیدروژل‌ها (EWC) عامل مهمی است که بر انتشار املاح و در نتیجه زنده ماندن سلول‌ها نیز تأثیر می‌گذارد. غلظت هیدروژل و پارامترهای اتصال عرضی دو عامل مهمی هستند که EWC را تحت تأثیر قرار می‌دهند. در این مطالعه نشان داده شد که GelMA توانایی جذب مقدار زیادی آب (۱ ± %۹۱) را دارد که نشان می‌دهد غلظت (۱۵% وزنی حجمی) و تراکم اتصال عرضی هیدروژل برای کپسوله‌سازی سلولی مناسب است. علاوه بر این، در مهندسی بافت استخوان اندازه منافذ برای مهاجرت سلولی و تشکیل استخوان حدود ۳۰۰ میکرومتر یا بزرگتر گزارش شده است که در این مطالعه اندازه منافذ ۵۵ ± ۴۴۰ میکرومتر گزارش شد.

شکل ۲) (a) تصویر سه بعدی (استریو میکروگراف) داربست PCL/GelMA از نمای بالا. رشته‌های سفید PCL هستند. GelMA پس از چاپ با برلیانت آبی رنگ آمیزی شد تا قابل مشاهده باشد. فلش‌های قرمز منافذ بین PCL و GelMA را نشان می دهند. (b) یک تصویر فلورسانس از DPSCها (رنگ آمیزی شده با Alexa FluorTM 488 phalloidin).

نتایج حاصل از سنجش سمیت، زنده‌مانی بیش از ۹۰% سلول‌ها در مدت زمان ۲۱ روز را نشان می‎دهد. زنده مانی و تکثیر بالای سلول حاکی از آن است که غلظت GelMA، پارامترهای پرینت و شرایط قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش مورد استفاده در این مطالعه برای ساخت داربست‌های سه بعدی مناسب هستند. علاوه بر این با توجه به شکل ۳ بیان استئوپنتین (OPN) و استئوکلسین (OCN) و رسوب CaP نشان داد که GelMA یک میکرومحیط مناسب برای حمایت از تمایز استخوان‌زایی سلول‌های بنیادی فراهم می‌کند.

شکل ۳) تمایز استخوانی DPSCها در داربست‌های PCL/GelMA. (a) رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی OPN و OCN در روزهای ۷ و ۲۱٫ (c) تجزیه و تحلیل نیمه کمی از شدت فلورسانس OPN و OCN نرمال شده به تعداد سلول. (d) تجزیه و تحلیل کمی رنگ آمیزی آلیزارین قرمز از GelMA حاوی DPSC نرمال شده به کنترل (GelMA بدون سلول). تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از ANOVA دو طرفه انجام شد. **p < 0.01 .

منبع:

Buyuksungur S, Hasirci V, Hasirci N. 3D printed hybrid bone constructs of PCL and dental pulp stem cells loaded GelMA. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2021 Dec;109(12):2425-37.