ECM چیست؟

ماتریس خارج سلولی (ECM) جزء اصلی غیر سلولی هر بافت و اندام است که پشتیبانی فیزیکی را فراهم می‌کند و نقش کلیدی در هموستاز و تمایز سلولی ایفا می‌کند. این ماتریس به عنوان یک داربست پویای سه بعدی عمل می‌کند که در آن سلول‌ها در بافت‎ها در کنار هم قرار می‌گیرند و از اجزای فیبریلار و گلیکوپروتئین‌های به هم پیوسته مختلف تشکیل شده است و شبکه هایی را تشکیل می‌دهند که به طور فعال با سلول‌ها از طریق گیرنده‌های سطح سلولی و/یا عوامل ماتریس ارتباط برقرار می‌کنند. اجزای کلیدی ECM پلیمرهایی مانند کلاژن، الاستین، فیبرونکتین یا هیالورونان، با نسبت ترکیبی مشخص هر اندام یا بافت است. ECM را می‌توان به ماتریس‌های بینابینی و اطراف سلولی تقسیم کرد. ماتریس‌های بینابینی از سلول‌های بافت همبند پشتیبانی می‌کنند، در حالیکه ماتریس‌های اطراف سلولی ساختارهای سلولی را احاطه کرده‌اند و برای عملکردهای سلولی و بافتی حیاتی هستند.

کلاژن و الاستین فراوان‌ترین اجزای ECM هستند و به طور نزدیک به هم پیوسته هستند و شبکه های فیبری را تشکیل می‌دهند. نوع کلاژن، قطر فیبر و جهت‌گیری، ویژگی‌های مشخصه هر بافت هستند و تا حدی سفتی و پایداری مکانیکی آن‌ها را تعیین می‌کنند. کلاژن نه تنها به عنوان پروتئین ساختاری عمل می کند، بلکه در بسیاری از عملکردهای سلولی نیز نقش دارد و همچنین می تواند معدنی شود و ECM کاملا سفت و سختی را مانند آنچه در استخوان یافت می‌شود، تشکیل دهد.

الاستین نقش مهمی در خواص مکانیکی پوست، ریه‌ها و عروق خونی دارد. گلیکوزامینوگلیکان‌ها مانند هیالورونان یا فیبرونکتین نیز نقش مهمی در ECM ایفا می‌کنند و در برهم کنش‌های سلول-ECM، حفظ آب و فراهم کردن ویسکوالاستیسیته بافت نقش مهمی دارند.

شباهت ECM و هیدروژل‌ها

همانند ECM، هیدروژل‌ها شبکه‌های پلیمری کراس لینک شده سه بعدی هستند که می‌توانند حلال آبی را به عنوان محیط‌های بیوفیزیکی و بیوشیمیایی قابل طراحی برای کنترل عملکرد و رفتار سلولی به داخل ساختار خود جذب کنند. به طور خلاصه، زنجیره‌های پلیمری توسط بخش‌های اتصال عرضی به هم متصل می‌شوند که به سیستم اجازه می‌دهد بیش از ۷۰ درصد وزن کل را آب جذب کند. مواد طبیعی به دلیل ویژگی‌های ذاتی‌شان، مانند شناسایی بیولوژیکی و حساسیت به تخریب، مزایایی دارند. آنها همچنین می توانند ECM های طبیعی را تقلید کنند که نقش حیاتی در تنظیم فرآیندهای پیچیده در تشکیل و بازسازی بافت دارند. هیدروژل‌ها به دلیل قابلیت تنظیم و زیست سازگاری مورد توجه حوزه زیست پزشکی قرار گرفته‌اند. علاوه بر این، قابلیت بارگذاری دارو/سلول، این زیست مواد با خواص منحصر به فرد را قادر می‌سازد تا به طور گسترده در زمینه زیست‌پزشکی به کار روند.

شکل ۱: ویژگی‌های اساسی هیدروژل‌های الهام گرفته از ECM

هیدروژل‌های ECM به عنوان جایگزین‌های بافتی استفاده شده‌اند که هدف اصلی در هنگام توسعه این مواد داشتن ویژگی‌های بیومکانیکی مشابه یا یکسان با ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مشابه با بافت اصلی باشد.

بررسی خواص مختلف هیدروژل‌های ECM

خواص فیزیکوشیمیایی

مشخصات فیزیکوشیمیایی هیدروژل‌ها اولین نیاز برای درک خواص هیدروژل‌های ECM است. آزمون‌های مختلفی برای بررسی خواص فیزیکوشیمیایی وجود دارد؛ از جمله:

طیف سنجی UV-vis

طیف‌سنجی (UV-vis) یک تکنیک پرکاربرد برای اندازه‌گیری غلظت ترکیبات مختلف به منظور نظارت بر پیوندهای عرضی، ژل شدن و سینتیک پلیمریزاسیون است. عمدتاً به جذب مولکول‌های خاص به طول موج‌های دقیقی بستگی دارد که می‌تواند باعث تحریک الکترون‌ها از زمین به سطوح انرژی بالاتر شود. بر این اساس، هویت و غلظت این ترکیبات را می‌توان تعیین کرد. تابش الکترومغناطیسی مورد نیاز ممکن است در ناحیه طیف نور UV (10-400 نانومتر) یا ناحیه طیف نور مرئی (۴۰۰-۷۵۰ نانومتر) قرار گیرد.

طیف سنجی رامان

علاوه بر جذب، نور ممکن است پراکنده نیز شود. پراکندگی الاستیک را پراکندگی رایلی می‌نامند و بیشتر فوتون‌ها به صورت الاستیک پراکنده می‌شوند. در مقابل، پراکندگی غیرالاستیک را پراکندگی رامان می‌نامند که نشان دهنده حداقل نسبت فوتون پراکنده است. علاوه بر این، طیف‌سنجی رامان برای تعیین برهمکنش و عملکرد سیستم هیدروژل ECM با ترکیبات بیولوژیکی استفاده می‌شود.

طیف سنجی FTIR

طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR) یک تکنیک پرکاربرد برای مطالعه برهم‌کنش‌های درون و بین مولکولی در سیستم‌های ماکرومولکولی خاص است. در این زمینه، تکنیک ATR-FTIR عمدتاً برای آزمایش نمونه ها به طور مستقیم در فاز جامد یا مایع، بدون یا با حداقل میزان آماده سازی لازم استفاده می‌شود.

طیف سنجی NMR

طیف سنجی تشدید مغناطیسی هسته (NMR) می‌تواند برای بررسی ژل شدن و سینتیک آن استفاده شود. NMR یکی از تکنیک‌های بسیار حساس است که برای تعیین ترکیبات شیمیایی مختلف استفاده می‌شود. هدف از آنالیر، هسته‌های اتم‌های مشخصی در مولکول‌های مورد نظر است و طیف‌سنجی H-NMR و C-NMR عمدتاً برای بررسی مواد مختلف و هیدروژل‌های ECM استفاده می‌شود. به طور خلاصه، طیف‌سنجی NMR بر تعداد پروتون‌ها و نوترون‌ها در هسته و اسپین کلی تکیه می‌کند: (۱) در طیف‌سنجی H-NMR، هسته اتم هیدروژن حاوی تنها یک پروتون است، بنابراین عدد کوانتومی اسپین ½ است. و (۲) در طیف‌سنجی C-NMR، هسته یک اتم کربن شامل شش پروتون و هفت نوترون است، بنابراین عدد کوانتومی اسپین همچنان ½ است.

خواص فیزیکی

بررسی تورم

خواص مکانیکی

سلول‌ها با محیط خارج سلولی و نیز با یکدیگر با قرار گرفتن مداوم در معرض محرک‌های مکانیکی خاص یا نشانه‌های فیزیکی، که از طریق انتقال مکانیکی به پاسخ‌های درون سلولی مشخص تبدیل می‌شوند، تعامل دارند. سازگاری سلول‌ها با این سیگنال‌های مکانیکی از طریق چندین مبدل مانند اسکلت سلولی اکتین، اتصال اینتگرین و تشکیل چسبندگی کانونی صورت می‌گیرد. با توجه به کشت سه بعدی سلول‌ها در هیدروژل‌ها، مشخص شد که خواص غیریکنواخت ژل به سلول‌ها اجازه می‌دهد تا به طور ناهمگن پر شوند. بنابراین، پاسخ سلولی غیر یکنواخت خواهد بود.

به طور کلی، ارزیابی خواص مکانیکی هیدروژل ها در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انجام می شود که در آن بیشتر کاربردهای بیولوژیکی هیدروژل ها اجرا می‌شود. آنها را میتوان قبل از آزمایش‌های برون تنی و نیز پس از کشت سلولی بعدی در هیدروژل‌ها به کار برد. همچنین این آزمون در مودهای مختلفی انجام می‌شود، از جمله: کشش، فشار، خمش و …

خواص رئولوژیکی

هیدروژل‌های ECM مواد ویسکوالاستیکی هستند و بسته به مکانیزم اتصال عرضی، می‌توانند سطوح مختلفی از رفتار ویسکوز یا الاستیک را نشان دهند. هنگامی که اتصالات عرضی تحت تنش اعمال شده برای شروع جریان هیدروژل شکسته می‌شوند، هیدروژل‌های کراس لینک شده فیزیکی خواص ویسکوز از خود نشان می‌دهند. بسیاری از فرمول‌های هیدروژل ECM نیز رفتار غیر نیوتنی نشان می‌دهند که در آن ویسکوزیته تحت تنش اعمال شده کاهش می‌یابد، خاصیتی به نام نازک شدن ناشی از برش (Shearthining). همچنین می‌توان از اتصالات عرضی برگشت‌پذیر استفاده کرد که منجر به خواص خود ترمیمی می‌شود که در آن ویسکوزیته مواد با حذف تنش اعمال‌شده بازیابی می‌شود.

رئولوژی یکی از رایج‌ترین تکنیک‌هایی است که در آن تغییر شکل‌های برشی دورانی روی یک ماده با سرعت‌های مختلف اعمال می‌شود. تنش دورانی بسته به خاصیت ویسکوالاستیک مورد نظر می‌تواند در مود تک جهتی یا نوسانی استفاده شود و انواع مختلفی از آزمایش‌ها وجود دارد که در ادامه بررسی خواهیم کرد.

تست چرخشی تک جهته

تست‌های رئولوژیکی چرخشی تک جهته برای مواد بسیار ویسکوز (مانند هیدروژل‌های بدون کراسلینک، هیدروژل‌های کراس لینک شده فیزیکی نرم) استفاده می‌شوند.

تست‌‌های چرخشی تک جهته ویسکوزیته را تحت سطوح کنترل شده‌ای از برش یا تنش اعمال شده اندازه گیری می‌کنند و ویسکوزیته با تقسیم تنش برشی بر نرخ کرنش برشی محاسبه می‌شود.

تست نوسانی

شکل ۲: مروری بر آزمایشات رئولوژیکی برروی هیدروژل‌های ECM

برای مواد ویسکوالاستیک که خاصیت الاستیک بیشتری از خود نشان می‌دهند (مانند هیدروژل‌های ECM با اتصال عرضی کووالانسی)، آزمایش‌های رئولوژیکی نوسانی باید انجام شود.

آنالیزهای حرارتی

آزمون‌های تخریب

بررسی‌های موروفولوژیکی

بررسی‌های برون تنی

شکل ۳: تکنیک‌های مختلف در آزمایشات برون تنی

مطابق با ISO 10993-5، برای آزمایش سمیت سلولی در شرایط برون تنی، باید خود نمونه یا عصاره ای از نمونه را آزمایش کرد، که چهار طرح آزمایشی معتبر اصلی را به ما می‌دهد که اغلب هنگام آزمایش عملکرد هیدروژل استفاده می‌شود:

کشت سلول‌ها بر روی هیدروژل

کشت سلول‌های به دام افتاده یا محصور شده در داخل هیدروژل

کشت سلول‌ها و سپس با هیدروژل در بالای آنها تریت کنید

یا سلول‌ها را با عصاره هیدروژل (محیط آماده شده، محلول شستشو، و/یا رهاسازی یک جزء/دارو) تریت کنید.

چالش‌های کار با هیدروژل‌ها و پیشرفت‌های این زمینه

چالش اصلی هیدروژل‌ها ناهمگنی و تنوع بچ به بچ آنها است، به ویژه برای هیدروژل‌های مشتق شده طبیعی مانند کلاژن، اسید هیالورونیک یا ماتریژل. به عنوان مثال، هیدروژل‌های کلاژن تجاری موجود عمدتاً از محصولات مشتق شده حیوانی که از پوست گاو یا دم موش استخراجی می‌شوند، ساخته می‌شوند. بنابراین این مواد از نظر ترکیب متغیر هستند و این موضوع می‌تواند تکرارپذیری تجربی را محدود کند. هیدروژل‎های مشتق شده از حیوانات نیز خطر انتقال پاتوژن یا ایمونوژن را به همراه دارند و پتانسیل آنها را برای کاربرد بالینی محدود می‌کند. در دسترس بودن اشکال غیر حیوانی این مواد امروزه در حال افزایش است. اکنون چندین تولید کننده هیالورونیک اسید با درجه دارویی را با استفاده از منابع میکروبی بدون حیوان تولید می‌کنند و کلاژن انسانی اکنون به صورت تجاری در دسترس است. به صورت جایگزین، هیدروژل‌های سنتزی ماتریس های کاملاً تعریف شده‌ای هستند که می‌توانند از نظر شیمیایی اصلاح شوند تا خواص بیوشیمیایی و بیوفیزیکی کنترل شده‌ای تولید کنند. هیدروژل‌ها همچنین برای تصویربرداری با روش‌های میکروسکوپی بسیار چالش برانگیز هستند، زیرا مقدار آب بالایی دارند.

پیچیدگی روزافزون تکنیک‌های موجود، مانند چاپ زیستی، لیتوگرافی، یا میکروفلوئودیک، به دانشمندان اجازه می‌دهد تا نسل بعدی مواد ECM را طراحی کنند. در حال حاضر تلاش‌های ترکیبی متخصصان علوم مواد، شیمی و زیست‌شناسی و مهندسی برای تعیین شکاف‌هایی که باید در این زمینه پر شود و نیز برای پیاده‌سازی اصول هر رشته با ابزارهای آنالیز موجود، امیدوارکننده‌ترین نقشه راه برای دستیابی به درک مکانیکی مناسب از خواص هیدروژل‌های ECM می‌باشد.

منبع:

S. Martin-Saldana, M. Al Waeel, A. M. Alsharabasy, A. Daly, and A. Pandit, “An interdisciplinary framework for the characterization of extracellular matrix-hydrogels for biomedical applications,” Matter, vol. 5, no. 11, pp. 3659-3705, 2022.